Jest to najstarszy budynek w klasztorze. Od tego miejsca wszystko się zaczęło. W tej kaplicy modlił się Święty, tu odprawiał Msze święte, głosił konferencje. To w niej bracia składali śluby zakonne.

Kaplica jest nazywana "porcjunkulą" klasztoru. Została zbudowana jesienią 1927 r. i otrzymała tytuł Niepokalanego Poczęcia NMP. Abp Aleksander Kakowski - metropolita warszawski (1913-1938), udzielił pozwolenia na to, by kaplica służyła zarówno zakonnikom, jak i okolicznej ludności. 12 listopada 1927 r. św. Maksymilian odprawił pierwszą Mszę św. w jeszcze nie ukończonej kaplicy. W uroczystość Niepokalanego Poczęcia NMP (8 grudnia 1927 r.) nowy klasztor poświęcił o. Kornel Czupryk - prowincjał franciszkanów prowincji polskiej.

Tuż przy zakrystii, w której przechowywane są ornaty, mszał i ampułki, używane przez św. Maksymiliana, można także zobaczyć pokój (celę zakonną) św. Maksymiliana, w którym on mieszkał od założenia Niepokalanowa w 1927 r. do 1930 r.

Obok kaplicy, od strony ulicy (dziś ul. Ojca Maksymiliana Kolbego) widać odrestaurowaną figurę Niepokalanej. Stoi ona na miejscu pierwszej figury, którą w 1927 r. postawił św. Maksymilian na jeszcze pustym polu, kiedy miał otrzymać teren od księcia Jana Druckiego-Lubeckiego. Figura Niepokalanej ukazuje ideę Niepokalanowa - klasztoru należącego do Niepokalanej i służącego Jej sprawie.

25 marca 2004 r. kard. Józef Glemp - Prymas Polski, wydał dekret, na mocy którego stara kaplica i bazylika zostały podniesione do rangi sanktuarium. Jednocześnie kardynał wyznaczył dni odpustów, które można uzyskać w sanktuarium: 14 sierpnia, 15 sierpnia oraz 8 grudnia.